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奶牛乳房炎防治技術指南(試行)
 

       奶牛乳房炎(Mastitis)是奶牛乳腺組織的炎癥,它的發生與病原微生物、奶牛自身因素、環境因素、管理因素及遺傳因素等密切相關,是奶牛最常見也是造成經濟損失最嚴重的疾病之一。同時,治療乳房炎時使用抗生素,可能誘導產生抗藥菌株并帶來抗生素殘留問題。有效控制乳房炎對于提高奶牛生產效益、減少經濟損失具有重要意義。
       為預防和控制奶牛乳房炎,依據《中華人民共和國動物防疫法》、《中華人民共和國食品衛生法》、《重大動物疫情應急條例》、《乳品質量安全監督管理條例》、《國家突發重大動物疫情應急預案》、《生乳》(GB19301-2010)、《生鮮乳生產技術規程》、《無公害食品奶牛飼養管理準則》、《奶牛場衛生及檢疫規范》、《無公害食品奶牛飼養獸醫防疫準則》及有關規定,制定本防治技術指南。
       1 適用范圍
       本指南規定了奶牛乳房炎的診斷、監測、報告、預防、治療和應急處置的操作程序、技術標準和保障措施。
       本指南適用于中華人民共和國境內一切與奶牛乳房炎防治有關的活動。
       2 診斷
       2.1 流行病學特點
       奶牛乳房炎的發生受多種因素的影響,飼養管理中飼養環境狀況、擠奶衛生條件、程序及護理措施的規范程度都與乳房炎的發生密切相關。乳房炎的發生與牛只自身因素如胎次、泌乳階段有相關性,23胎后,隨著產犢胎次的增加,患病機會增加;隨著泌乳時間的延長,患病機會增加;分娩期的感染率較其它時期高數倍。本病的發生與氣候和季節變化也有一定關系,多發于雨季、酷暑及寒冬。
       2.2 發病原因
       誘發乳房炎的因素主要有以下幾個方面:
       2.2.1飼養管理
       環境衛生狀況較差、飼養管理水平低下、擠奶設備使用不正確、擠奶程序不規范、不注意擠奶衛生等是誘發乳房炎的重要原因。
       2.2.2病原微生物
       引起乳房炎的病原微生物主要包括細菌、真菌、病毒、支原體。根據病原的來源和傳播方式可分為接觸傳染性病原體和環境性病原體兩類。前者主要包括無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、支原體等;后者主要包括大腸桿菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯菌等。臨床病例中,鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌最為常見。
       2.2.3其它因素
    季節、氣候、遺傳因素以及其它疾病等都對乳房炎的發生有一定影響。
       總之,引起乳房炎的因素在很多情況下都是多重性的,在診斷時應全面考慮。
       2.3 診斷
       2.3.1臨床診斷
       乳房炎按臨床表現可分為臨床型和亞臨床型(通常稱為隱性乳房炎),臨床型又可分為急性型、亞急性型和慢性型。
       2.3.1.1 急性乳房炎。突然發病,乳房發紅、腫脹、變硬、疼痛,乳汁顯著異常和減少,出現全身癥狀。病牛體溫升高,食欲減退,反芻減少,脈搏增速,脫水,全身衰弱、沉郁。當病情發展很快且癥狀嚴重時為最急性乳房炎,此時可危及患牛生命。
      
2.3.1.2 亞急性乳房炎。病牛一般沒有全身癥狀,最明顯的異常是乳汁中有絮片、凝塊,并呈水樣。乳房有輕微發熱、腫脹和疼痛。
       2.3.1.3 慢性乳房炎。慢性乳房炎多由長時間持續感染引起,或由于急性乳房炎未及時進行有效治療而轉來。長期保持亞臨床型乳房炎,或亞臨床型和臨床型交替出現,臨床癥狀長期存在。最終可導致乳腺組織纖維化,乳房萎縮、出現硬結。這類乳房炎治療價值不大,而且是牛群中的感染源,應及早淘汰。
       2.3.1.4 亞臨床型乳房炎。患牛的乳房和乳汁肉眼觀察無異常,但乳汁理化性質發生變化,乳汁體細胞數增加。隱性乳房炎患牛是病原攜帶者,可以感染其它健康牛。由于臨床癥狀不明顯,易被忽視而造成奶量損失和健康牛感染的危險。
       2.3.2實驗室診斷
       2.3.2.1 臨床型乳房炎
    臨床型乳房炎主要根據臨床癥狀進行診斷。病原微生物實驗室診斷見附件1、2。
       2.3.2.2 亞臨床型乳房炎
    檢測方法包括乳汁體細胞計數法(CMT和體細胞直接計數法)、乳汁pH檢驗法、電導率值檢驗法、酶類檢測法和乳成分直接檢測法。本指南主要介紹體細胞計數法。檢測方法參見附件3、4,可以選擇其中之一進行。
       如需進行病原微生物的檢測,參見附件1、2。
       3監測與報告
       3.1 奶牛飼養單位或個人每月應對亞臨床型乳房炎進行監測,并根據監測結果采取相應措施,監測記錄存檔;對臨床型乳房炎要準確診斷,及時治療,并保存診療記錄。大規模發生臨床型乳房炎時,要及時向當地獸醫主管部門報告。
       3.2獸醫主管部門應對乳房炎發病及監測情況進行定期監控。
       4處置
       4.1 臨床型乳房炎處置
       4.1.1隔離
       對患病奶牛實施隔離,對病牛接觸過的一切用具及環境進行徹底消毒。
       4.1.2治療
       對已經確診的病牛,應根據病因素采取有效治療措施,按照對癥治療、局部治療、抗感染和輔助性治療相結合的原則,防止病原擴散。
       4.1.2.1抗感染治療:可選用抗感染藥物治療。治療前應進行乳汁采樣、病原培養、藥敏實驗以確定所使用藥物的種類。
       4.1.2.2對癥治療:解熱、鎮痛、抗過敏。
       4.1.2.3 輔助性治療:緩解乳房的腫脹,可采用乳房基部封閉、乳房按摩、增加擠乳次數、乳房冷敷、外敷藥物等。
       4.1.3牛奶處理
       臨床型乳房炎奶牛的奶要擠入專用容器內,集中銷毀,應嚴格執行休藥期和棄奶規定;對發病區的奶源進行嚴格監測,防止病原污染牛奶進入制冷罐、乳品加工企業和消費市場。
       4.2 亞臨床型乳房炎處置
       4.2.1奶牛的處置
     對已診斷為亞臨床型乳房炎的病牛應隔離觀察。長期CMT陽性、乳汁表現異常、產奶量低、反復發作的病牛,要及時淘汰。干乳前10天進行隱性乳房監測,對陽性反應在“++”以上的牛及時治療,干乳前3天再監測1次,陰性反應方可停乳。
       4.2.2牛奶的處置
       應嚴格執行休藥期和棄奶規定。
       4.3 消毒
       選用合適的藥物藥浴乳頭;對病牛污染的場所、用具、物品,特別是擠奶設備進行清洗和嚴格消毒,消毒方法見附件5。
       5 預防措施
    堅持預防為主、防治結合的原則,創造良好的衛生環境,采取科學的管理方法,執行正確的擠奶程序,以減少奶牛乳房炎的發生。
       5.1創造良好的衛生環境
    良好的衛生環境是預防乳房炎的關鍵。牛舍、運動場要設計合理,空間寬敞,保持陽光充足;牛床要保持清潔、干燥,墊草應干、軟、清潔、新鮮,經常更換。要定期對牛舍和運動場進行消毒,乳房炎高發季節應加強消毒。
    獸醫部門應加強對奶牛場動物防疫條件審查與監督管理。
       5.2 加強飼養管理
    根據奶牛的營養需要,執行規范化飼養,各生產階段精、粗飼料搭配合理,全面供應,增加青綠、青貯料的飼喂量,以奶定料,維持機體最佳生理機能。停乳后要隨時觀察乳房,發現異常應立即處理;在干奶后期應適當增加精料的飼喂量;為減輕乳房水腫,要適當控制鹽的攝入量和多汁飼料的喂量。在飼養管理過程中要避免應激。同時,還要適當增加奶牛的運動,以增強機體抗病力。
    在干奶期,每頭奶牛每天供應1.0g維生素E,和每公斤日糧不超過0.3mg的硒。
       5.3 規范擠奶操作
    擠奶操作建議采用兩次藥浴,紙巾干擦。
       5.3.1擠奶前檢查:擠奶前先觀察或觸摸乳房外表是否有紅、腫、熱、痛癥狀或創傷。
       5.3.2乳頭預藥?。?/span>選用專用的乳頭藥浴液,對乳頭進行預藥浴,藥液作用時間應保持在2030秒。(注:乳房污染嚴重時,可先用含消毒劑的溫水清洗干凈,再藥浴乳頭)
       5.3.3擦干乳頭:藥浴后用一次性紙巾擦干乳頭和基部,要求每頭牛至少1張。
       5.3.4擠頭2-3把奶:把頭2-3把奶擠到專用容器中,檢查牛奶是否有凝塊、絮狀物或呈水樣,牛奶正常的牛方可上機擠奶;異常的,應及時報告獸醫進行治療,單獨擠奶,嚴禁將異常奶混入正常牛奶中。
       5.3.5上機擠奶:上述工作結束后,及時套上擠奶杯組(套杯過程中盡量避免空氣進入杯組中),奶牛從進入擠奶廳到套上奶杯的時間應控制在90秒內。擠奶過程中觀察真空穩定情況和擠奶杯組奶流情況,適當調整擠奶杯組的位置。排乳接近結束,先關閉真空,再移走擠奶杯組。嚴禁下壓擠奶機,避免過度擠奶。
       5.3.6擠奶后藥?。?/span>擠奶結束后,應迅速進行乳頭藥浴,停留時間為35秒。
       5.4 定期檢查
       加強對乳房炎的監控,每月對每頭泌乳牛進行奶牛乳房炎檢測。
       5.5 干奶期預防
    干奶前首先進行隱性乳房炎檢測,陰性奶牛方可進行干奶。提倡一次性干奶。乳汁擠凈后,向每個乳區注入適量的干奶藥。  
      
       附件1 

       金黃色葡萄球菌的檢驗

       1 主要試劑和試驗方法:
       1.1 革蘭氏染色:
       1.1.1涂片、火焰固定。
       1.1.2草酸銨結晶紫染1min。
    草酸銨結晶紫染液的配制:
       溶液A:結晶紫2g,95%酒精20mL,溶液B:草酸銨0.8g,蒸餾水80mL。將A、B溶液混合,用濾紙過濾后即可使用。
       1.1.3自來水沖洗。
       1.1.4加碘液覆蓋涂面染約1min。
       1.1.5水洗,用吸水紙吸去水分。
       1.1.695%酒精數滴,并輕輕搖動進行脫色,20s后水洗,吸去水分。
       1.1.7沙黃液(?。┤?/span>2min后,自來水沖洗。干燥,鏡檢。
       革蘭氏陽性菌染色為藍色,革蘭氏陰性菌染色為紅色。
       1.2 觸酶試驗:取槽置于潔凈的試管內或玻片上,然后加3%過氧化氫數滴;或直接滴加3%過氧化氫于不含血液的細菌培養物中,立即觀察結果。有大量氣泡產生者為陽性,無則為陰性。
       1.3 血漿凝固酶試驗:吸取0.5mL兔血漿與0.5mL金黃色葡萄球菌浸液肉湯24h培養物充分混勻,置36±1°C培養,每隔半小時觀察一次,連續觀察6h,出現凝固,即將小試管傾斜或倒置時,內容物不流動,判為陽性。同時做陰陽性對照。
       2 乳樣的采集
       選取出現臨床癥狀(或者懷疑為亞臨床型乳房炎)乳房炎奶牛,先用溫水,再用0.2%新潔爾滅擦洗乳房,最后用70%的酒精擦拭乳頭。采樣者同時進行手指擦拭消毒。每個乳室先擠去頭23把奶,以排除污染的雜菌,每頭奶牛取乳樣5mL于無菌乳樣杯中,待檢。
       3 病原菌的分離培養
       初步診斷:將少量乳汁涂片、革蘭氏染色、鏡檢。如可見圓球形革蘭氏陽性細菌可懷疑為葡萄球菌。
       分離培養:將乳樣搖勻,分別取適量接種于營養肉湯(10%血清)、鮮血瓊脂、麥康凱瓊脂培養基(平板)后,置于37℃溫箱培養2448h。觀察每個平板中細菌生長的情況,記錄菌落生長表現。
       普通瓊脂平板上,37℃,2472h培養后,可見到濕潤、光滑、隆起的圓形金黃色菌落。挑取典型菌落涂片、染色、鏡檢(鏡檢呈葡萄狀排列,無芽胞、莢膜,直徑0.51μm,革蘭氏染色陽性),并挑取單個可疑菌落移植于肉湯和斜面培養基,經37℃培養2448h。24h后沒有長菌的平板,再用相應的增菌肉湯涂劃一次,繼續培養,2448h后,再作檢查,以防漏檢。將剩余的乳樣存放于4℃冰箱內備用。 營養肉湯中呈渾濁生長,管底有少量灰白色沉淀;血液瓊脂平板中菌落較大,呈金黃色、圓形,周圍出現明顯的β-溶血。
       4 生化鑒定
       觸酶試驗:觸酶陽性
       血漿凝固酶試驗:凝固酶試驗陽性
       糖發酵試驗:能分解甘露醇、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖
       色素產生情況:能產生金黃色色素
       5 毒力試驗
       將上述經過生化試驗鑒定的細菌懸液用滅菌生理鹽水作適當稀釋,對隨機分組的小鼠進行腹腔注射接種,接種量為0.5mL/只(家兔皮下接種1.0mL或者靜脈接種0.10.5mL),能夠致死動物或者內臟出現膿腫可以確定有毒力。
       6 病原菌的重分離試驗
       對接種后發病、死亡小鼠(家兔)的肝臟進行病原菌重分離。進行菌落涂片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查,觀察所分離菌株是否為原接種菌。如果是則進一步確定病原菌為金黃色葡萄球菌。
       附件2 

鏈球菌的檢驗

        引起臨床型乳房炎或者亞臨床型乳房炎的鏈球菌常見的有無乳鏈球菌、停乳鏈球菌以及乳房鏈球菌。
        1 主要試劑和試驗方法
        CAMP試驗:在血瓊脂平板上用金黃色葡萄球菌培養物劃一條直線,然后將鏈球菌培養物劃一條線,與金黃色葡萄球菌培養物的劃線相互垂直,但不要接觸,二者相距35mm,各鏈球菌分離菌劃線間距1020mm。置37℃溫箱內培養24h后觀察結果。在兩劃線交界處出現箭頭樣的溶血區為陽性。
        2 乳樣的采集
        選取出現臨床癥狀(或者懷疑為亞臨床型乳房炎)乳房炎奶牛,先用溫水,再用0.2%新潔爾滅擦洗乳房,最后用70%的酒精擦拭乳頭。采樣者同時進行手指擦拭消毒。每個乳室先擠去頭23把奶,以排除污染的雜菌,每頭奶牛取乳樣5mL于無菌乳樣杯中,待檢。
        3 病原菌的分離培養
        初步診斷:將少量乳汁涂片、革蘭氏染色、鏡檢。如可見圓球形革蘭氏陽性細菌可懷疑為鏈球菌。
        分離培養:將乳樣搖勻,分別取適量接種于營養肉湯(10%血清)、鮮血瓊脂、麥康凱瓊脂培養基(平板)后,置于37℃溫箱培養2448h。觀察每個平板中細菌生長的情況,記錄菌落生長表現。 普通瓊脂平板上,37℃,2472h培養后,未見到菌落。鮮血瓊脂平板上長有灰白色、半透明表面光滑圓形隆起的小菌落,出現溶血現象,如果是β溶血則疑為無乳鏈球菌,如果為α溶血,疑為停乳鏈球菌或者乳房鏈球菌,如為γ溶血,則疑為乳房鏈球菌。血清肉湯中生長初呈均勻渾濁,管底出現絮狀沉淀,上清變得透明。挑取典型菌落涂片、染色、鏡檢,鏡檢如呈球狀,短鏈狀或者長鏈狀排列,無芽胞、莢膜,革蘭氏染色陽性則疑為鏈球菌。
        4 生化鑒定
        鏡檢形態符合鏈球菌特性,且接觸酶試驗陰性細菌,即鑒定為鏈球菌屬細菌。若細菌CAMP試驗陽性,不水解七葉苷和馬尿酸鈉,即鑒定為無乳鏈球菌;若細菌CAMP試驗陰性,不水解七葉苷和馬尿酸鈉,即鑒定為停乳鏈球菌;若細菌CAMP試驗陰性,水解七葉苷和馬尿酸鈉,即鑒定為乳房鏈球菌。
        5 動物試驗
        對實驗動物,只有停乳鏈球菌具有致病性,將其18h血清肉湯培養物0.5mL注入小白鼠腹腔,或給家兔靜脈接種12mL,可使動物在1周內死亡。對接種后發病、死亡小鼠(家兔)的肝臟進行病原菌重分離。進行菌落涂片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查,觀察所分離菌株是否為原接種菌。如果是則進一步確定病原菌為停乳鏈球菌。其他兩種鏈球菌并不能使試驗動物致死。
        附件3 

乳汁體細胞計數法
        推薦使用體細胞計數儀進行乳汁體細胞計數。
        體細胞計數法有直接計數法和間接計數法。直接計數法中簡便易行的方法是直接用顯微鏡進行體細胞計數(SCC),間接計數法就是后面提到的CMT法。
        1 主要試劑和材料
        美藍染色液:美藍乙醇飽和溶液30mL(美藍2g,95%乙醇100mL),10%氫氧化鈉溶液0.1mL,蒸餾水100mL,將上列溶液混合搖勻,過濾后備用。二甲苯、95%乙醇。生物顯微鏡、載玻片、10μL 微量加樣器(或移液槍)等。
        2 操作方法
        2.1 涂片制備
        涂布:充分搖勻新鮮乳樣,用10μL 微量加樣器吸取中部乳汁10μL ,或用接種環蘸取等量的乳汁,將乳樣滴于玻片一端中側,仔細涂布成約1cm2面積的乳膜(為便于操作,可在玻片下墊襯一張硬紙板,紙板上用毛筆劃數個面積為1cm2的方格透視)。干燥、脫脂、固定:涂好乳膜的玻片于37℃溫箱中干燥,然后用二甲苯脫脂5min,再置95%乙醇中固定510min。
        染色:玻片干燥后,用美藍染色液染色5min。水洗,再用95%乙醇脫色數分鐘,水洗干燥后鏡檢。
        鏡檢及計數:在生物顯微鏡油鏡下觀察(最好用10×目鏡,其視野直徑要求為0.016),計數100個視野內的細胞數,然后用下式計算:SCC=100×N/πr2,視野面積πr2=3.1416×(0.016/2)2=0.0002cm2,顯微鏡系數N =1/0.0002×100=500,000,SCC=系數×每個視野的細胞平均數 (即細胞總數÷100)=細胞數/mL乳。
        3 判定標準
        隨著國際和國內乳品行業的接軌,國內標準也在提高,一般以每毫升牛奶中含20萬個細胞為亞臨床乳房炎的臨界值(+);超過該值為陽性,低于該值則正常。
        附件4 
加州乳房炎檢測法(CMT)
        CMT是加州乳房炎試驗的簡稱,即首先在美國加利福尼亞州使用的一種乳房炎檢測試驗。它是通過間接測定乳中體細胞數(SCC)來診斷隱性乳房炎的方法。其原理是在表面活性物質和堿性藥物作用下,乳中體細胞被破壞,釋放出DNA,進一步作用,使乳汁產生沉淀或形成凝膠。體細胞數越多,產生的沉淀或凝膠也越多,從而間接診斷乳房炎和炎癥的程度。該法是國際通用的隱性乳房炎診斷方法,其特點是簡便、快速。我國研制出了類似的方法如BMT(北京奶牛研究所)、SMT(上海奶牛研究所、HMT(黑龍江省獸醫科學研究所),以及LMT(中國農科院蘭州獸醫研究所)等。
        1 試劑和方法
        CMT檢測中用到的試劑和方法如下:十二烷基磺酸鈉30g溶解于1000mL蒸餾水, 2M的氫氧化鈉調節PH等于6.4,加入溴甲酚紫0.1g,即成CMT檢驗液, 取乳房炎診斷盤1只,滴加被檢乳2mL,診斷液2mL,緩緩作同心圓狀擺市售成品CMT診斷試劑或者其他方法的成品試劑,按照說明操作。
        2 判定標準:可以參考表1。
1 CMT法的判定方法及標準
 
反應判定
被檢乳
反應狀態
體細胞數
(千/毫升)
陰性
混合物呈液體狀,傾斜檢驗盤時,流動流暢,無凝塊
0200
±
可疑
混合物呈液體狀,盤底有微量沉淀物,搖動時消失
200500
弱陽性
盤底出現少量黏性沉淀物,非全部形成凝膠狀,搖動時,沉淀物散布于盤底,有一定的黏性
500800
++
陽性
全部呈凝膠狀,有一定黏性,回轉時向心集中,不易散開
8005000
+++
強陽性
混合物大部分或全部形成明顯的膠狀沉淀物,黏稠,幾乎完全黏附與盤底,旋轉搖動時,沉淀集于中心,難以散開
>50
 
 

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